تست كومبس مستقيم (DAT) در سال ١٩٤٥ آقاي كومبس با همكارانش گروهي از آنمي ها هموليتيك را كه علتش گروهي از آنتي بادي ها بودند تشخيص دادند به همين دليل روند اين آزمايش را ” كومبس” نام گذاري كردند.
كومبس مستقيم، حساس شدن گلبولهاي قرمز را در داخل گردش خون توسط آنتي بادي و يا اجزاءكمپلمان و يا هر دو را نشان مي دهد.
در حالت عادي “برای مثال” rbc با چندين IgG يا اجزا كمپلمان (حدود ٤٠ تا ٥٠) آغشتگي دارد، اما زماني كومبس + است كه اين اتصالات بيشتر باشد (حدود ٥٠٠).
در اثر اين اتصالات، بدن واكنش مي دهد مثلا ماكروفاژ با Fc رسپتور هاي خود به Fc آنتي بادي هاي متصل به rbc مي چسبد و باعث تخليه آن مي شود و اين تست براي تشخيص و جلوگيري از اين واكنش انجام مي شود.
موارد كاربرد
١. تشخيص آنمي اتوايميون يا hemolytic anemia ناشی از تولید اتو انتی بادی علیه گلبول های قرمز خودی است.
٢. بیماری های همولیتیکی نوزادان یا erythroblastosis fetalis که به علت ناسازگاری خونی خصوصا Rh بین مادر و جنین است.
٣. كم خوني همولیتیک متعاقب مصرف برخي از داروها
٤. كم خوني همولیتیک در نتيجه آلو آنتي بادي هاي ناشي از تزريق خون كه اخيراً به بيمار صورت گرفته است .
٥. هموگلوبينوري حمله اي سرد (PCH)
از این تست برای شناسایی آنتیبادیهای ناقص ـ که بر روی RBC نشسته و آنها را حساس کرده است استفاده میشود. این تست به دو روش مستقیم و غیرمستقیم انجام میشود. اساس این تست بر ایجاد شبکه بین آنتیبادیهای ناقص در سطح گلبولهای قرمز حساس شده (توسط AHG) برای ایجاد آگلوتیناسیون میباشد. این تست در دو مرحله کلی انجام میشود:
۱. مرحله حساس شدن
۲. اضافه کردن معرف کومبز
کومبز مستقیم
از کومبز مستقیم برای شناسایی آنتیبادیهای ناقص متصل به RBC جنین استفاده میشود. تفاوتی که بین کومبز مستقیم و غیرمستقیم وجود دارد این است که، مرحله حساس شدن گلبولهای قرمز در بدن جنین اتفاق میافتد. عامل اصلی حساس شدن RBC (در ۷۵% موارد) ناسازگاری گروههای خونی RH میباشد هر چند که گروههای خونی ABO در ۲۵ درصد موارد هم میتوانند باعث حساس شدن RBC شوند.
ناسازگاری RH
اگر خون جنین+Rh و خون مادر -Rh باشد آنتیبادیهای تولید شده از کلاس Igg در بدن مادر از جفت عبور کرده و باعث حساس شدن RBCهای جنین میشود.
ناسازگاری ABO
این ناسازگاری زمانی باعث حساس شدن RBC میشود که گروه خونی مادرO و گروه خونی جنین AB باشد در این صورت آنتیبادی 3 Igg آنتی AB موجود در سرم مادر به جنین منتقل شده و باعث حساس شدن RBC جنین میشود.
روش انجام تست کومبز مستقیم
خون بند ناف را گرفته و از آن سوسپانسیون ۵ درصد گلبولهای قرمز تهیه میکنیم. چون مرحله حساس شدن RBC در بدن جنین اتفاق افتاده است بنابراین نیازی به انکوبه کردن نیست.
۰/۱ میلیلیتر از سوسپانسیون ۵ درصد RBC را به ۱/۰میلی لیتر AHG اضافه میکنیم و برای تشکیل شبکه بین RBC، لولههای تست را به مدت ۳ تا ۵ دقیقه در دمای آزمایشگاه نگه میداریم. بعد از ۵ دقیقه، لولهها را در۱۰۰۰ و به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ میکنیم. در آخر هم لولهها را از نظر آگلوتیناسیون با زدن ضربهای ضعیف به لوله، بررسی میکنیم.
بررسی نتایج
اگر آگلوتیناسیون مشاهده شود، نشان دهنده حساس بودن RBC جنین است و باید تعیین تیتر شود (که در این تعیین تیتر، AHG را رقیق می کنیم نه سرم را) چون در زایمان دوم به بعد باعث HDN در نوزادان میشود.
کومبز غیرمستقیم
از کومبز غیرمستقیم برای شناسای RBC حساس شده در محیط In vitro استفاده میشود. مرحله حساس شدن RBCها در این روش توسط انکوباسیون انجام میشود. مراحل بعدی تقریبا مشابه کومبز مستقیم است. در این تست آنتیبادیهای ناقص، در خون مریض (مادر) وجود دارد. این آنتیبادیها به دو علت عمده ممکن است تولید شوند:
۱. انتقال خون
۲. زایمان اول
برای بررسی وجود و یا عدم وجود این آنتیبادی، از سوسپانسیون ۵ درصد RBC، گروه خونی +O استفاده میشود. چون آنتیبادیهای ناقص، شاخصهای آنتیژن RBCهای گروه خونی +O را حساس و با اضافه کردن AHG باعث ایجاد آگلوتیناسیون میشود.
علت استفاده از +O
برای اینکه ناسازگاری گروههای خونی ABO را از بین ببریم از این گروه خونی استفاده میکنیم چون اگر گروههای خونی A,B,AB استفاد شود، در این صورت ممکن است آنتیبادی ضد AB گروه خونی O باعث حساس شدن سوسپانسیون شود.
و علت اینکه از +RH استفاده میکنیم این است که میخواهیم آنتیبادیهای ناقص بر روی آنتیژنهای +RH بشیند و بتوانیم آگلوتیناسیون را مشاهده کنیم. اگر -RH باشد در روی RBC، آنتیژنی وجود نخواهد داشت تا RBC توسط آنتیبادی حساس شود.
روش انجام تست کومبز غیرمستقیم
۰/۱ میلیمتر از سرم بیمار را با ۱/۰ میلیمتر از سوسپانسیون ۵ درصد مخلوط میکنیم و سپس لوله آزمایش را به مدت ۳۰ تا ۴۰ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه قرار میدهیم در این مرحله RBC در صورت وجود آنتیبادی ناقص در سرم، حساس خواهند شد. بعد از این مدت، لوله آزمایش را به مدت یک دقیقه در دور ۱۰۰۰ سانتریفیوژ میکنیم. و سه بار توسط سرم فیزیولوژی شستشو میدهیم تا آنتیبادیهای غیراختصاصی حذف شوند و فقط آنتیبادیهای اختصاصی که به شاخصهای آنتیژنی RBC چسبیدهاند، باقی بمانند. بعد از این مراحل یک قطره AHG به لوله اضافه میکنیم و بعد از ۳ تا ۵ دقیقه لوله را به مدت یک دقیقه در دور ۱۰۰۰ سانتریفیوژ میکنیم و در آخر هم با زدن ضربهای ضعیف آگلوتیناسیون را بررسی میکینم.
بررسی نتایج
اگر آگلوتیناسیون مشاهده شود تست کومبز غیرمستقیم بیمار را مثبت گزارش میکنیم.
چند نکته:
۱ـ قبل از انکوبه با اضافه کردن دو قطره آلبومین میتوان آگلوتیناسیون را بهتر بررسی کرد.
۲ـ اگر بعد از انکوبه، آگلوتیناسیون مشاهد شود نشان دهنده این نکته است که در سرم ما آنتیبادی کامل وجود دارد و در واقع Back Type را انجام دادهایم.
۳- برای بررسی آگلوتیناسیون بهتر است از میکروسکوپ استفاده کنیم.
روش تهیه سوسپاسیون ۵ درصد
۲ قطره خون داخل لوله آزمایش میریزیم. ۳ میلیلیتر سرم فیزیولوژی به لوله اضافه میكنیم و در سانتریفیوژ در دور ۳۰۰۰ به مدت ۵ دقیقه قرار میدهیم سپس مایع رویی را خالی كرده و این كار را تا ۳ بار تكرار میكنیم.
