اساس اندازه گیری پروتئین در ادرار به صورت كمی و نیمه كمی و كیفی بر پایه روشهای ایمونوشیمی، كدورت سنجی و شیمیایی با استفاده از نوارهای تشخیصی می باشد. در این میان روش كدورت سنجی به علت ساده و مقرون به صرفه بودن در آزمایشگاهها كاربرد بیشتری دارد. با توجه به تحقیقات انجام شده روش TCA با استفاده از طول موج ۴۰۵ نانومتر برای سنجش مقادیر كم پروتئین به عنوان روش انتخابی معرفی می شود.
ضمناً در بررسی روشها، عوامل كیفی شامل صحت، دقت، محدوده اندازه گیری، خطی بودن و یكنواختی نتایج در استفاده از كالیبراتورهای متفاوت تعیین گردیده و سپس روش اصلح انتخاب شده است.
اساس آزمایش
در این روش پروتئین ادرار توسط تری كلرواستیك اسید ۵/۱۲در صد رسوب داده می شود. كدورت ایجاد شده متناسب با مقدار پروتئین (آلبومین و گلبولین) موجود در ادرار است. غلظت پروتئین رسوب داده شده با در نظر گرفتن غلظت اسید، دما و زمان سپری شدن بین اضافه كردن اسید تا ایجاد رسوب پروتئین محاسبه می گردد.
جمع آوری نمونه
در این آزمایش می توان از ادرار بصورت انتخابی (Random) استفاده كرد ولی ادرار ۱۲ یا ۲۴ ساعته ترجیح داده می شود. البته نمونه ادرار ۱۲ یا ۲۴ ساعته باید بدون افزودن ماده نگهدارنده جمع آوری شده و در تمام مدت نمونه گیری، ظرف حاوی نمونه در محل خنك نگهداری شود. برای جمع آوری باید از ظرف تمیز و عاری از آلودگی استفاده نمود و به بیمار آموزش داده شود كه برای جمع آوری ادرار ۲۴ ساعته، از ساعت ۸ صبح تا ۸ صبح روز بعد تمامی نمونه های پس از ساعت ۸ بطور كامل جمع آوری شده ولی ادرار ساعت ۸ صبح روز اول جمع آوری نگردد. باید توجه نمود كه اگر اندازه گیری پروتئین ادرار در مدت ۴۸ ساعت پس از نمونه گیری انجام نمی شود، می توان نمونه را خوب مخلوط كرده و پس از تعیین حجم نمونه، بخشی از آن را تا روز انجام آزمایش در فریزر نگهداری نمود.
طرز تهیه TCA صد در صد ذخیره
به علت حالت خورندگی TCA باید تهیه محلول با احتیاط و با محافظت از چشمها و دستها انجام گیرد و پس از پایان كار ظروف مورد استفاده كاملاً شسته شوند.
۱۷۵ میلی لیتر آب مقطر دیونیزه شده را به یك ظرف حاوی ۵۰۰ گرم از TCA اضافه می كنیم. درب ظرف را بسته و به آرامی تكان می دهیم تا كاملاً حل شود. سپس تمام مواد را به طور كامل به یك بالن ۵۰۰ میلی لیتری منتقل می كنیم و حجم كل را به ۵۰۰ میلی لیتر می رسانیم. برای انحلال كامل طی مدت ۲۴ ساعت، محلول راگهگاه با عمل چرخش مخلوط می نمائیم.
محلول TCA صد درصد را در یك ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری می كنیم. این محلول برای ۱۲ ماه پایدار است.
طرز تهیه تری كلرواستیک اسید ۵/۱۲در صد (۷۶۵ میلی مول بر لیتر)
با استفاده از پیپت حجمی ۲۵ میلی متری، مقدار ۲۵میلی لیتر از محلول TCA۱۰۰درصد را به بالن ژوژه ۲۰۰ میلی لیتری منتقل می نماییم و با استفاده از آب مقطر حجم آن را به ۲۰۰ میلی لیتر می رسانیم. محلول حاصله را كاملا مخلوط كرده و در ظرف شیشه ای تیره در دمای اتاق نگهداری می نماییم. این محلول در دمای اتاق به مدت یك ماه پایدار است.
كنترل
از سرم كنترلهای تجاری به عنوان كنترل استفاده می گردد (رقتی برابر۳۰۰/۱ با استفاده از سرم فیزیولوژی تهیه می شود).
استاندارد
برای آزمایشهای روتین (روزانه) از سرم كنترلهایی ترجیحا با ارزش مرجع مانند precipath و Biorad و precinorm مشابه استفاده می شود. برای انجام كار ابتدا غلظت پروتئین این سرم كنترلها را به مقداری كه امكان وجود آن در ادرار است می رسانیم. (برای رقیق كردن از سرم فیزیولوژی استفاده میشود)
لازم به ذكر است كه این روش تا ۵۰۰ میلی گرم بر دسی لیتر خطی می باشد، بنابراین نمونه ها اعم از ادرار و استاندارد باید طوری رقیق شود كه غلظت پروتئین موجود در آنها حداكثر ۵۰۰ میلی گرم بر دسی لیتر باشد.
توجه: از یك نوع نمونه كنترل نمی توان همزمان بعنوان كنترل و استاندارد استفاده نمود.
روش كار
۱) ۱۰ میلی لیتر از ادرار مورد آزمایش را سانتریفوژ نموده سپس با استفاده از نوار ادراری پروتئین آن را بررسی می كنیم و نتیجه را ثبت می نماییم. اگر غلظت پروتئین بیش از ۱+ بود نمونه ادرار را قبل از شروع آزمایش با سرم فیزیولوژی رقیق میكنیم. (نمونه های ۱+ تقریباً به نسبت ۵۰/۱ و نمونه های ۲+ تقریباً ۱۰/۱ و نمونه های ۳+ تقریباً ۱۵/۱ رقیق می شوند). اگر نیتریت ادرار مثبت باشد، می باید بیمار را برای نمونه گیری مجدد با رعایت شرایط نمونه گیری راهنمایی نموده و در صورت تكرار آلودگی نمونه، بیمار جهت مشاوره و لزوم بررسی نتایج كامل ادرار و احتمالاً درخواست كشت به پزشك معرفی گردد.
۲) برای هر آزمایش (نمونه، كنترل و استاندارد) دو لوله در نظر می گیریم (یكی به عنوان بلانك و دیگری به عنوان آزمایش)
۳) ۱/۶میلی لیتر از نمونه ادرار، استاندارد و كنترل را در لوله های مربوطه ریخته و سپس ۴/۰میلی لیتر از محلول TCA ۱۲/۵درصد به همه لوله ها اضافه می نماییم. و بعد به آرامی لوله ها را مخلوط می کنیم.
دما در این مرحله مؤثر بوده و می باید بین ۲۳ تا ۲۷ درجه سانتی گراد باشد.
لوله های بلانك را بعد از مدت ۲۰ دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۵۰۰ سانتریفوژ مینماییم.
لوله های آزمایش را بعد از ۳۵ دقیقه كاملاً مخلوط نموده و جذب نوری آنها را در طول موج ۴۰۵ یا ۴۵۰ نانومتر در مقابل مایع رویی بلانك مربوطه بدست می آوریم.
رعایت زمان ۳۵ دقیقه برای این آزمایش ضروری می باشد.
محاسبه
میلی گرم پروتئین در ادرار ۲۴ ساعته=
ضریب رقت نمونه × حجم ادرار ۲۴ ساعته (میلی لیتر) × F × جذب نوری آزمایش
F= حاصل تقسیم مقدار استاندارد بر جذب استاندارد
با توجه به توانائی این روش برای سنجش مقادیر كم پروتئین (حدود ۲۵ میلی گرم در لیتر پروتئین و بیشتر)، از این روش می توان برای غربالگری وضعیت كلیوی جمعیتهای مستعد به بیماری كلیوی مانند مبتلایان به دیابت در راستای بررسی میكروپروتئینوری استفاده نمود.
در افراد سالم مقدار دفع پروتئین تام تا ۱۵۰میلی گرم بر لیتر در ادرار طبیعی می باشد.
نكات قابل توجه
۱) كدورت حاصله از اضافه شدن TCA به ادرار به دلیل وجود آلبومین و گلبولین می باشد.
۲) هر نمونه باید در مقابل بلانك مربوط به خود اندازه گیری شود.
۳) PH قلیایی و پیگمانهای ادرار باعث ایجاد نتایج مثبت كاذب می شود.
۴) دفع پروتئین در ادرار به طور دائم ثابت و مشخص نمی باشد و در دوره های ۲۴ ساعته تغییر قابل ملاحظه ای دارد. بنابراین برای اندازه گیری پروتئین دفع شده بهتر است از ادرار ۲۴ ساعته استفاده نمود.
۵) ممكن است بین نتایج بدست آمده از روش كدورت سنجی TCA و بررسی ادرار توسط نوارهای ادراری تفاوت وجود داشته باشد. مشاهده نتایج منفی یا مقادیر كمی پروتئین با نوار ادراری و نتیجه مثبت با روش TCA به طور همزمان ممكن است به دلایل زیر باشد:
وجود پروتئین Myeloma (گاما گلبولین و پروتئین بنس جونز) در ادرار.
نمونه های غیر هموژن به علت استفاده از داروهای خاص مانند Tolmetin و داروهای ضدالتهاب كه در درمان آرتریت روماتوئید استفاده می شود. متابولیتهای این داروها می تواند باعث ایجاد نتایج مثبت كاذب شود.
